植物中SOD的分离提取及性质研究

前言：

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发觉的唯一的以自由基为底物的酶。

SOD普遍存在于生物界，是防御氧迫害的关键酶。SOD要紧有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们一起的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严峻的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于医治辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食物中，可用于保健食物添加剂；在化妆品中，可避免皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰硕，因此，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确信SOD同工酶类型。

材料及方式： 一、试剂

(1) l磷酸盐缓冲溶液 (2) 50mmol/l Tris-HCL

(3) mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液:准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量 mol/L 的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用 mol/L 的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保留可用1～2d。

(4) × 10－4 mol/L NBT溶液:准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶顶用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保留可用2～3d。

(5)含μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液:

A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（MW=）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

C液：归并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保留可用8～10d。该溶液应避光保留，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保留。

当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。

(6) mol/L 磷酸钠缓冲液

取 mol/L 的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶顶用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保留备用。

(7) 50mmol/l邻苯三氛：称取邻苯三氛0.063g，用10mmol/lHCL溶液溶解，定容至10ml，避光保留

附录I

pH L Na2HPO4 L NaH2PO4 附录II

Tris-HCl缓冲溶液（L Tris 溶液和X mL L HCl混匀后，加水稀释到100mL）

pX/mL H H pX/mL H pX/mL

二.实验仪器

移液管、离心机

5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量

移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培育皿、日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等

三.实验内容

（1）大蒜粗酶液的提取

Ⅰ.提取：称20g左右的大蒜至于研钵(事前冷藏)中，充分研磨使细胞破碎，再加入5ml l 的磷酸盐缓冲溶液(事前冷藏)，继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min，离心10min，弃去沉淀，得提取液。

Ⅱ.掏出杂蛋白：提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，5000r/min离心10min，掏出杂蛋白，得粗酶液。

Ⅲ.沉淀SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，5000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2ml 的磷酸盐缓冲溶液中。

Ⅳ.热击处置： 把提抽原液注入已编号的试管然后将试管置入恒温水槽，温度设置为60℃，热击20min。高速离心去杂取上层清液。稀释5倍，待用。

（2）SOD性质的研究

Ⅰ.酶活力的测定（NBT法）

每一个处置取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反映系统整体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可依如实验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。

各试剂全数加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强

为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后当即遮光终止反映。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，依照其他各杯液的光密度别离计算出不同酶液量的各反映系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。

表1 反映系统中各试剂及酶液的加入量（mL）

蛋氨磷酸酸（Met）NBT溶液 酶 核黄素溶液 试 剂 钠缓冲液 磷酸钠缓液 杯 号 冲液 1 2 3 4 5 6 0 0 0 7 8 Ⅱ.阻碍SOD样液活性的因素 ①不同PH对酶活力的阻碍： 第一取6支试管按下表加入试剂

试管 1 试 剂ml SOD 酶液 磷酸缓冲液（PH） 蒸 馏 水 2 3 4 5 6 2 2 2 2 2 2 在最适温度下，水浴10min,取出 邻苯三酚 吸 光 值 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反映，在420nm下测定吸光度。

②不同温度对酶活力的阻碍: 第一取5支试管按下表加入试剂

试 管 1号 试 剂ml 温度处理 磷酸缓冲液 SOD酶液 蒸 馏 水 0 3 2 25 3 2 50 3 2 75 3 2 100 3 2 2号 3号 4号 5号 在各自的温度下静置10min,然后取出 邻苯三酚 吸 光 值 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反映，在420nm下测定吸光度。

③抑制剂的阻碍：

按下表4支试管加入试剂

试 管 试 剂ml ％ H2O2 SOD酶液 1 15μl 2 20μl 3 25uL 4 30ul 于30℃水浴恒温30min，取出迅速冷却至25℃ 邻苯三酚 吸 光 值 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反映，在420nm下测定吸光度。

（3）PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型

Ⅰ.配胶 ①.分离胶：

试剂名称 用量/ml 30% ACR/Bis 8 pH 50mmol/L Tris-HCl 5 10% SDS 10% 过硫酸铵 蒸馏水 TEMED ②.浓缩胶

贮液 100mL溶液中含量 pH 凝胶的配置 E 核黄素 4mg B 1M HCl 48ml Tris 5.9g TEMED 浓缩胶T=% B:D:E:F=1:3:1:3 D Acr 10g Bis 2.5g F 蔗糖 40g ③.电极缓冲溶液

溶剂名称 量 100mL溶液中含pH 配置 电极缓冲液 6g Tris 用时稀释10倍 甘28.8g 氨酸 蒸1L 馏水 Ⅱ.操作 ①.制胶

按配方在模具中灌注分离胶后，警惕的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚归并使凝胶表面垂直。凝胶在30-40℃放置约40分钟-1小时后，能够看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶

缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为避免气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在30-40℃，聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚）

②.加样

按下表加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。（Mn-SOD的活性受氯仿-乙醇的阻碍，Cu-Zn-SOD和Fe-SOD这两种同工酶均对H2O2酶感，Cu-SOD对KCN酶感，Mn-SOD不受CN的阻碍）

编号 试剂 1 2 3 粗酶液/ul 20 20 20 40%蔗糖溶液/ul （含%溴酚蓝） 20 20 20 氯仿-乙醇/ul -- 7 -- 30% H2O2/ul -- -- 7 蒸馏水 7 -- -- 待各管溶液配置好后，别离取10ul加入凝胶的3个齿上。 ③.电泳

SOD同工酶的分离采纳不持续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。连接电源，调剂电流至15mA,带样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘1-2cm时，关闭电源，电泳终止。

④.染色

SOD活性染色 取凝胶板，采纳SOD负染色方式，按以下顺序浸泡于培育皿中染色：

i.在×10-3mol/l氮蓝四唑(NBT)黑暗下浸泡20分钟; ii.在×10-2mol/l 磷酸钠缓冲溶液(含×10-2mol/l TEMED、×10-5mol/l核黄素）中，在黑暗条件下浸泡15min.

×10-2mol/L 磷酸钠缓冲溶液。凝胶板移入此浸泡液，在4×108W日光灯下光照射20~30min.

经上述染色和光照后的凝胶板，在蓝色背景上出现清晰的透明的SOD活性染色带。染色后的胶板用水漂洗数次后，比较观察凝胶板条带，分析得出结论。 四.实验数据整理及分析 ①.酶活力的测定

杯 号

1

2

3

4

5

6

7

8

2、3号平均

值

酶液量（mL）

0

0

0

— 100

光密度（OD560nm） 0 抑制率（％）

— 100 100