植物中SOD的分离提取及性质研究

前言：

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。

SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。

材料及方法： 一、试剂

(1) PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液 (2) PH8.2 50mmol/l Tris-HCL

(3)0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液:准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。

(4)7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液:准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。

(5)含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液: A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。

当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。

(6)0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液

取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

(7) 50mmol/l邻苯三氛：称取邻苯三氛0.063g，用10mmol/lHCL溶液溶解，定容至10ml，避光保存

附录I

pH 0.2mol/L Na2HPO4 0.2mol/L NaH2PO4 5.8 8.0 92.0 6.0 12.3 87.7 6.2 18.5 81.5 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 49.0 51.0 7.0 61.0 39.0 7.2 72.0 28.0 7.4 81.0 19.0 7.6 87.0 13.0 7.8 91.5 8.5 8.0 附录II

94.7 5.3 Tris-HCl缓冲溶液（0.05mol/L Tris 溶液和X mL 0.1mol/L HCl混匀后，加水稀释到100mL）

pX/mL H H pX/mL H pX/mL 745.7 .1 .8 734.5 .5 814.7 744.7 .2 .9 732.0 .6 812.4 743.4 .3 .0 829.2 .7 810.3 742.0 .4 .1 826.2 .8 88.5 740.3 .5 .2 819.9 .9 87.0 738.5 .6 .3 817.2 .0 95.7 736.6 .7 .4 8

二.实验仪器

移液管、离心机

5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量

移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等

三.实验内容

（1）大蒜粗酶液的提取

Ⅰ.提取：称20g左右的大蒜至于研钵(事先冷藏)中，充分研磨使细胞破碎，再加入5ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸盐缓冲溶液(事先冷藏)，继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min，离心10min，弃去沉淀，得提取液。

Ⅱ.取出杂蛋白：提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，5000r/min离心10min，取出杂蛋白，得粗酶液。

Ⅲ.沉淀SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，5000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2ml PH7.8的磷酸盐缓冲溶液中。

Ⅳ.热击处理： 把提抽原液注入已编号的试管然后将试管置入恒温水槽，温度设置为60℃，热击20min。高速离心去杂取上层清液。稀释5倍，待用。

（2）SOD性质的研究

Ⅰ.酶活力的测定（NBT法）

每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。

各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。

表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）

蛋氨pH7.8酸（Met）磷酸钠缓磷酸钠缓液 杯 号 冲液 冲液 液 素溶液 NBT溶酶 核黄 试 剂 1 2 3 4 5 6 7 8 0.9 0.9 0.9 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Ⅱ.影响SOD样液活性的因素 ①不同PH对酶活力的影响： 首先取6支试管按下表加入试剂

试管 1 试 剂ml SOD 酶液 磷酸缓冲液（PH） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 2 3 4 5 6 5.8 6.4 7.0 7.6 7.8 8.0 蒸 馏 水 2 2 2 2 2 2 0.2 在最适温度下，水浴10min,取出 邻苯三酚 吸 光 值 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。

②不同温度对酶活力的影响: 首先取5支试管按下表加入试剂

试 管 1号 试 剂ml 温度处理 PH7.6磷酸缓冲液 SOD酶液 蒸 馏 水 0 25 50 75 100 2号 3号 4号 5号 3 3 3 3 3 0.1 2 0.1 2 0.1 2 0.1 2 0.1 2 在各自的温度下静置10min,然后取出 邻苯三酚 吸 光 值 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。

③抑制剂的影响：

按下表4支试管加入试剂

试 管 试 剂ml 1.5％ H2O2 SOD酶液 1 15μl 0.1 2 20μl 0.1 3 25uL 0.1 4 30ul 0.1 于30℃水浴恒温30min，取出迅速冷却至25℃ 邻苯三酚 吸 光 值 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓HCl停止反应，在420nm下测定吸光度。

（3）PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型

Ⅰ.配胶 ①.分离胶：

试剂名称 用量/ml 30% ACR/Bis 8 pH 8.8 50mmol/L Tris-HCl 5 10% SDS 0.2 10% 过硫酸铵 0.1 蒸馏水 6.7 TEMED 0.01 ②.浓缩胶

贮液 100mL溶液中含量 pH 凝胶的配置 E 核黄素 4mg 浓缩胶T=3.75% B:D:E:F=1:3:1:3 B 1M HCl 48ml Tris 5.9g TEMED 0.46ml 6.7 D Acr 10g Bis 2.5g F 蔗糖 40g ③.电极缓冲溶液

溶剂名称 量 100mL溶液中含pH 配置 电极缓冲液 6g Tris 甘28.8g 氨酸 8.3 用时稀释10倍 蒸1L 馏水 Ⅱ.操作 ①.制胶

按配方在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。凝胶在30-40℃放置约40分钟-1小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在30-40℃，聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚）

②.加样

按下表加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。（Mn-SOD的活性受氯仿-乙醇的影响，Cu-Zn-SOD和Fe-SOD这两种同工酶均对H2O2酶感，Cu-SOD对KCN酶感，Mn-SOD不受CN

的影响）

编号 试剂 1 2 3 粗酶液/ul 20 20 20 40%蔗糖溶液/ul （含0.1%溴酚蓝） 20 20 20 氯仿-乙醇/ul -- 7 -- 30% H2O2/ul -- -- 7 蒸馏水 7 -- -- 待各管溶液配置好后，分别取10ul加入凝胶的3个齿上。 ③.电泳

SOD同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。连接电源，调节电流至15mA,带样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘1-2cm时，关闭电源，电泳结束。

④.染色

SOD活性染色 取凝胶板，采用SOD负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色：

i.在2.45×10-3mol/l氮蓝四唑(NBT)黑暗下浸泡20分钟; ii.在3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液(含2.8×10-2mol/l TEMED、2.8×10-5mol/l核黄素）中，在黑暗条件下浸泡15min.

iii.5×10-2mol/L pH7.8磷酸钠缓冲溶液。凝胶板移入此浸泡液，在4×108W日光灯下光照射20~30min.

经上述染色和光照后的凝胶板，在蓝色背景上出现清晰的透明的SOD活性染色带。染色后的胶板用水漂洗数次后，比较观察凝胶板条带，分析得出结论。 四.实验数据整理及分析 ①.酶活力的测定

杯 号

1

2

3

4

5

6

7

8

2、3号平均

值

酶液量（mL）

0

0

0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

— 100

光密度（OD560nm） 0 抑制率（％）

— 100 100