前沿空间蛋白质组学：一种强大的细胞生物学发现工具

真核细胞⾼度区室化，⽣物过程被分隔在不同的区室进⾏。蛋⽩质功能与亚细胞定位密切相关，不同的区室提供不同的化学环境（例如pH和氧化还原条件）、不同的潜在作⽤配体或底物。因此，对蛋⽩质亚细胞定位的严格控制是细胞⽣理学的重要调控内容。

⼤多数细胞⽣物学过程涉及蛋⽩质亚细胞定位的变化，例如转录因⼦在细胞核-胞浆的穿梭、细胞凋亡过程中线粒体蛋⽩的重新定位，以及细胞表⾯信号传导受体的内吞等。相反，蛋⽩质的错误定位通常与细胞功能障碍和疾病相关，包括神经变性、癌症和代谢紊乱等。

以蛋⽩质空间定位为研究⽅向的空间蛋⽩质组现在已经⽤于揭⽰⼈类蛋⽩质组的复杂结构，如单细胞变异、动态蛋⽩质易位，相互作⽤⽹络改变，以及蛋⽩定位改变等。⼀些研究者也已成功运⽤空间蛋⽩质组学来研究疾病，包括急性病毒感染、肝病等。

2019年5⽉，KTH 瑞典皇家理⼯学院的 Emma Lundberg 教授和德国马克斯-普朗克研究所的Georg H. H. Borner 教授，在国际著名期刊 Nature Reviews | Molecular Cell

Biology（IF=35.612）发表了题为《Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell

biology》的综述性⽂章，系统介绍了空间蛋⽩质组学的技术、未来发展的机遇与挑战。下⾯⼩编为⼤家解读⼀下这篇综述。01

空间蛋⽩质组学研究⽅法

⽬前三种互补的⽅法可⽤于空间蛋⽩质组学研究：细胞器分级的质谱分析（图1）、蛋⽩质与蛋⽩质互作⽹络分析（图2），以及基于蛋⽩质定位的蛋⽩质成像（图3）。1）基于质谱的细胞器分级⽅法

质谱可⽤于复杂混合物中蛋⽩质的定性和定量研究。空间蛋⽩质组学可借助传统⽣物化学分析⽅法，如下图1a 所⽰，通过定制的亚细胞分级分离（如，梯度离⼼或差速离⼼）来富集⽬标细胞器（绿⾊）。然后利⽤质谱⽅法只分析富集到的组分。此⽅法鉴定出来的蛋⽩质包含⽬标细胞器蛋⽩和共富集污染物（红⾊和蓝⾊），且⽆法区分，因⽽不推荐。图1a 空间蛋⽩质组学基于质谱进⾏细胞器分级分析

下图1b 为单细胞器分析法，定量质谱⽅法可对⽬标馏分和某⼏个相邻或相近馏分进⾏检测。对于每种蛋⽩质都可获得丰度分布曲线。此⽅法可通过统计分析区分污染物（红⾊和蓝⾊），污染物可被识别，但却不⼀定能分解为不同的类别。图1b 单细胞器分析法

下图1c 为多细胞器分析法，应⽤亚细胞分级⽅案，同时分离所有的细胞器。由于没有进⾏细胞器“纯化”，因⽽细胞器很⼤程度上重叠分布。之后对亚细胞分级进⾏定量质谱分析。每个细胞器都有⾃⼰独特的蛋⽩轮廓，通过对蛋⽩聚类分析，并使⽤已有的细胞器标记，对聚类蛋⽩进⾏注释。

图1c 多细胞器分析法

⽬前基于多细胞器分析的质谱⽅法，在细胞器分离⽅法、质谱定量策略，以及⽣物信息分析⽅法上，衍⽣出多种技术改进⽅案。不论何种⽅案，过去3年发表的多细胞器分析的应⽤中，都实现了⾮常⾼⽔平的细胞器分辨率（≥10个亚细胞区室）、蛋⽩质组学覆盖率（> 5,000个蛋⽩质），以及分类的准确率（通常> 90%）（表1）。表1.基于质谱的多细胞器分析的当前实施⽅式

另外值得⼀提的是，由于质谱的⾼分辨率，细胞器质谱图本质上提供了⼤量潜在的相互作⽤的组学数据。如，作为同⼀复合物的蛋⽩质在细胞器图谱上显⽰为微团簇，这⼀特征可⽤于鉴定新型蛋⽩质复合物（图1d）。此外，细胞器图谱原则上可提供肽段⽔平的分辨率（图1e），并揭⽰不同的蛋⽩质剪接体、蛋⽩⽔解加⼯形式，以及与翻译后修饰相关的多种定位差异。随着质谱技术的进⼀步发展，基于肽⽔平的细胞器定位可能会为解开蛋⽩质亚细胞定位的复杂性做出重⼤贡献。

图1de 空间蛋⽩质组学基于细胞器质谱图进⾏细胞器分级分析2）基于蛋⽩互作⽹络的空间蛋⽩质组研究⽅法

蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤普遍使⽤基于质谱的、抗体介导的亲和纯化-MS（AP-MS）来进⾏研究。使⽤抗体从复杂样本（如全细胞裂解物）中亲和纯化蛋⽩质及其结合配体，后续 MS 分析鉴定（图2a）。

图2a 通过蛋⽩互作⽹络研究空间蛋⽩质组学

从概念上将，由于相互作⽤的蛋⽩必须位于相同的亚细胞位置，所以蛋⽩质的相互作⽤组可以认为是“局部”的空间蛋⽩质组。使⽤相互作⽤的诱饵蛋⽩进⾏多个 AP-MS 实验，也可以揭⽰⼀个具有空间信息的蛋⽩关联⽹络（图2b）。图2b

邻近标记法对于细胞器的 AP-MS ⼗分有帮助。诱饵蛋⽩可以使⽤⼈⼯合成的抗坏⾎酸过氧化物酶（APEX）或⽣物素连接酶（BioID）进⾏标记。⽣物素连接酶可以催化诱饵蛋⽩紧邻（<10-20nm）蛋⽩质的⽣物素化。因⽽质谱分析的靶标蛋⽩不仅包括诱饵蛋⽩、与诱饵蛋⽩直接结合的配体，还包括瞬时相互作⽤的蛋⽩，以及位置紧密相连但不直接结合的蛋⽩（图2c）。由于少量诱饵蛋⽩便可获取丰富的空间信息，因⽽此⽅法可以在不需要亚细胞分级的情况下获得全⾯的区室蛋⽩质组（图2d）。

图2cd

当在同⼀系统中进⾏多个 AP-MS 或邻近标签标记实验时，诱饵蛋⽩和结合配体会在不同实验中重复出现（如在b部分中）。来⾃相同亚细胞定位的多个诱饵蛋⽩会揭⽰各个区室的详细图谱，⽽区室与区室⼜通过相互间的映射连接，最终便可以构建细胞全部亚细胞区室的空间蛋⽩质图谱（图2e）。图2e

3）基于成像的空间蛋⽩质组⽅法

基于成像的空间蛋⽩质组学提供了在⾃然细胞环境下可视化研究蛋⽩质的机会，⽽不需要在蛋⽩质组学分析之前进⾏细胞裂解或细胞器的分离（图3）。基于成像的蛋⽩质定位便于研究具有多模式细胞器定位的蛋⽩质研究，实际上⼤多数的蛋⽩质也是定位于多个亚细胞区室的。此外，越来越多的研究表明，遗传背景相同的细胞群体也会在蛋⽩表达⽔平、蛋⽩定位上表现为差异。基于成像的空间蛋⽩质组学技术有助于通过捕获单细胞分辨率下的蛋⽩空间分布来研究这种可变性。蛋⽩质的可视化成像，通常使⽤抗体，或荧光蛋⽩的融合表达来实现。图3. 基于成像的空间蛋⽩质组的多种处理⽅式02

未来空间蛋⽩质组学的机遇与挑战

许多因素使得细胞蛋⽩质组⽐仅从基因数⽬进⾏的蛋⽩预测，要复杂的多。空间蛋⽩质组则最有希望解开这种有趣的细胞复杂性。

1）帮助识别多定位和“兼职”蛋⽩，了解细胞复杂功能

约50%的⼈类蛋⽩是定位于多个亚细胞区室的。这些蛋⽩质是否具有特定的兼职功能？“兼职”（Moonlighting）蛋⽩被定义为具有两种或更多不同细胞功能的蛋⽩质，这些细胞功能不是由遗传变异、RNA 剪接或基因多重效应引起的，⽽是由亚细胞定位，底物，寡聚化或翻译后修饰（PTM）的差异引起的。已知的兼职蛋⽩数量正在迅速增加。据估计，23％的⼈体蛋⽩质是兼职蛋⽩。78％的已知兼职蛋⽩参与疾病发⽣发展，48％是⽬前的药物靶点。基于成像的空间蛋⽩质组学将是识别多定位蛋⽩质的关键技术，以更好地理解它们在复杂细胞功能中的关键作⽤。

2）帮助发现多种蛋⽩质存在形式（Proteoforms）

蛋⽩质的每种分⼦形式都称之为⼀种蛋⽩质形式，这种变化主要是由于 DNA 序列的变异

性，RNA 剪接和不同的翻译后修饰，如磷酸化，泛素化，烷基化和糖基化所引起的。典型的⼈类细胞预估含有600万个共存的蛋⽩质形式。虽然这个数字远远低于理论上可能的组合数量，但它揭⽰了蛋⽩质组的巨⼤复杂性。基于质谱（MS）的空间蛋⽩质组学，可以提供关于蛋⽩质存在形式和亚细胞定位的新见解。3）获取蛋⽩质丰度信息

⼈体细胞蛋⽩丰度跨越7个数量级，为了模拟细胞的⽣物学过程，需要了解每个细胞的绝对蛋⽩的数⽬及其变化。基于质谱和基于成像的空间蛋⽩质组学，可以提供这些信息。4）获得蛋⽩质层⾯的单细胞变异性信息

越来越清楚的是，遗传上相同的细胞群显⽰出蛋⽩质表达的变异。我们对这种细胞异质性的后果的理解仍然不成熟。基于成像的⽅法可能在阐明致病因素⽅⾯起关键作⽤。5）了解蛋⽩质定位的动态信息

蛋⽩质亚细胞定位受到严格控制，许多蛋⽩质响应刺激，扰动或疾病⽽改变定位。全球⽐较空间蛋⽩质组学，基于成像，基于相互作⽤或基于 MS，提供了在系统⽔平捕获这些⽣理和病理蛋⽩质易位的理想⼯具，并且应该成为细胞⽣物学家的⼴泛发现⼯具。

综上，基于质谱与成像的空间蛋⽩质组有助于全⾯了解细胞的复杂性。⽽且后续空间蛋⽩质组学与其他组学的结合，也将利于发现更多的⽣物信息。例如，转录组学可以提供细胞特异性表达，如剪接变体、单核苷酸多态性等数据信息，从⽽使空间蛋⽩质组学能够发现新的蛋⽩质形式。空间蛋⽩质组学与代谢组学的结合，可以在功能上发现细胞器重排与代谢变化的相关性。与之类似地，RNA 测序与空间蛋⽩质组学相结合，有可能将 mRNA 与亚细胞定位联系起来。因此作者认为，空间蛋⽩质组学应该成为细胞绘图⼯作中的整合技术，例如⼈类细胞图谱，旨在表征所有⼈类细胞类型。参考⽂献：

Lundberg E, Borner GHH. Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology. NatRev Mol Cell Biol. 2019 May;20(5):285-302. doi: 10.1038/s41580-018-0094-y.

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