燕麦中可溶性膳食纤维(β-葡聚糖)的提取

燕麦是世界粮食作物之一,也是我围北方各省重要的小杂粮作物.燕麦〔oats〕不但营养价值高,而且医学研究证明,常吃燕麦有降血脂,降血糖和减少心血管疾病的作用.所以美国食品和药物管理局许可在商标或广告上宣传燕麦的降低胆固醇,预防心脏病的作用.国内外科学研究认为,燕麦的保健功能主要归功于燕麦中可溶性燕麦纤维——β-葡聚糖.它是对人体健康十分有益的—种可溶性膳食纤维(SDF), 这种可溶成分在燕麦麸中的含量远高于燕麦胚乳,在燕麦麸中为6.6%～11.3%.在去皮的燕麦粉中为3.0%～5.4%.

燕麦麸中的β—葡聚糖含量在4%～10%之间,且可溶部分占65%～90%.由于目前国内对燕麦β—葡聚糖的提取研究不多.大量的燕麦麸仅作为饲料用,经济效益不高.因此积极开展对燕麦麸的深加工利用,进行β—葡聚糖的提取和研究,有着重大的现实意义和良好的应用前景.

因此.如果将过去认为是废物的燕麦麸进行深加工利用,对开发保健食品或功能食品具有十分广阔的前景. 1 实验方法 1.1 原料的预处理

1.1.1可溶性膳食纤维物质(β-葡聚糖)的富集

提取燕麦中的可溶性膳食纤维或β-葡聚糖,关键是要明确β-葡聚糖位于燕麦籽粒中的部位.国外Wood and Fulcher.《燕麦,化学和工艺》中表明β-葡聚糖主要存在于胚乳细胞壁中,在次糊粉层中大量浓缩.这就说明可以对燕麦经过研磨,将富集可溶性膳食纤维物质(β-葡聚糖)的麸皮分离出来.但在除去胚乳时必须小心防止次糊粉层的胚乳细胞壁过多地随面粉分离出去. 1.1.2 研磨 燕麦粉

燕麦→清理→研磨→ 燕麦麸皮

用布勒试验磨粉机装置对燕麦进行研磨,制成60%的燕麦粉和40%的燕麦麸皮,麸皮中富集β-葡聚糖. 1.2

燕麦麸中可溶性膳食纤维(β-葡聚糖)的提取工艺

燕麦麸→粉碎→过筛(60目)→加水搅拌提取(调pH9.0,70℃)→离心收集上清液→去蛋白(搅拌下调pH至4.5并静置)→离心收集上清液→醇析(调pH至7.0,80%酒精沉淀)→离心收集沉淀,干燥→β—葡聚糖粗品 提取后的物质溶于水,不溶于乙醇.故可以用乙醇进行醇析. 1.3 可溶性膳食纤维的定测方法 实验中使用可溶性膳食纤维的测定方法. 1.4 β-葡聚糖的测定方法:

50mg试样中加入1m180%酒精润湿,之后再加入20m1醋酸钠缓冲液(pH5.5),沸水浴溶解;取出后50水浴中恒温10min,加入40Uβ—葡聚糖酶反应1h;冷却到室温,定容至100m1,取0.1m1(两份),加入0.2Uβ—葡萄糖苦酶,50℃反应10min;葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量,推算β—葡聚糖含量,由此求得葡聚糖纯度. 2 实验结果分析

2.1 各因素对β—葡聚糖提取率的影响 2.1.1 粉碎粒度对提取率的影响

麸皮粒度对提取率有一定的影响,粒度越大,大部分β—葡聚糖尚被颗粒所包裹,不能被提取出来;但粒度太小,澄清困难,粗品中淀粉含量多,色泽不佳.故选择其粒度为40～60目. 2.1.2 料水比对提取率影响

根据液固萃取基本理论,增大提取液的量将有利于溶质的溶出.但过大的液固比对实际生产过程来说是没有意义的,不仅增加水的消耗及后续的浓缩成本,而且容易导致加工过程中溶质的丢失.本实验研究60℃,pH9.0,提取时间1h条件下,料水比在1:9—1:21之间提取情况. 料液比 1:9 1:12

1:15 1:20 得率 3.1 3.3 3.4 3.5

2.1.3 提取温度对提取率影响

液固比,pH,提取时间分别固定为15,7.0,1h,研究提取温度的变化对提取率影响. 温度 40 50 60 70 得率 1.5 2.5 3.2 4.2

2.1.4 pH对提取率和色泽的影响

在50℃下提取1h,液固比为15的条件下研究pH对提取率影响

一般在稀碱条件下进行提取,这是由β—葡聚糖本身的碱溶性质决定的.随着pH的升高,提取率也增加,同时提取液颜色也逐渐加深. 选择PH值为9.0 2.1.5 蛋白的去除

麸皮中存在大量蛋白会造成制品纯度不高,选择等电点沉淀法去除蛋白. 在搅拌下调pH至4.5并静置,用离心法去除沉淀. 2.2 粗品的纯化 2.2.1 淀粉的检测

准确称取NSP样品0.1g,加水定容至100ml,取一滴于白瓷扳上,加碘液1滴,如碘液不显蓝色,表明样品中不含淀粉,可直接进行纯化.若碘液呈显蓝色,则表明混有淀粉,需进行纯化预处理. 2.2.2 纯化的预处理

由于在热水浸提过程中,随着淀粉在提取液中的糊化,导致它和多糖一起提取出来,因此有必要在制备过程中用酶法除去淀粉.淀粉的去除效果以碘液与提取液反应所产生的颜色变化作为评判标准,颜色越浅表示淀粉残余含量越低,若无颜色变化,即可认为淀粉已水解完全.

将提取液用O.1mol/L Na0H调pH至5.5～6.O,于恒温水浴上加热至92℃,加lml α-淀粉酶溶液恒温酶解,并经常搅拌,酶解过程中淀粉检测,直至没有蓝色为止. 二,β-葡聚糖的功能性 1,β一葡聚糖降血糖功能:

研究结果表明:用含5%燕麦可溶性膳食纤维饲料喂养的实验组大鼠,其血糖含量明显低于对照组,仅为对照组的68.9%.该结果与国外文献相关报道一致.该结果表明:NSP是莜麦中降低血糖的主要有效成份之一,它能使高血糖大鼠体内血糖明显降低.该结果也为阐明莜麦血糖指数最低的原因提供了有益的参考:由于莜麦中所含的NSP是富强粉的9.0倍,大量NSP的存在而使得莜麦粉的血糖指数很低o

NSP降低血糖的原因可能是因为NSP的存在增加了胃内容物的粘滞性,使得胃排空延迟,从而防止了爱后血糖急剧上升,同时可镕性膳食纤维进人小肠,又使小肠内不搅水层加厚而降低了糖的吸收,因此阳P具有降低血糖的功能.

2 β一葡聚糖降血脂作用

β一葡聚糖对高血脂人群有明显的降低胆固醇作用. 可以用四种代谢机制来解释这一作用结果:

(1)这种可溶性淀粉在肠道内与胆酸结合,使循环至肝的胆酸量减少.这样,可促使胆固醇分解胆酸,来满足内源代谢和循环的需要.只有一小部分胆固醇与胆酸结合随粪便一起排外,所以,经粪便排除并不是降低胆固醇的主要原因.

(2)可溶性淀粉在肠内微生物菌丛的作用下发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)——乙酸,丙酸和丁酸.这些SCFAs经过门静脉被吸收,通过抑制HMG—CoA(胆固醇生物分解作用的限速酶)的活力,可以阻止肝胆固醇的合成,提高LDL—C的分解作用.但是,据最新研究结果表明.只有SCFAs之丙酸有作用.

(3)可溶性淀粉可以减缓胃的排空,这样可以减少由于多食引起的血中胰岛素的提高.这一作用可以减少通过HMG—COA合成肝胆固醇.

(4)燕麦可溶性淀粉可提高肠道内粘度,从而抑制膳食中脂肪的吸收,其中包括胆固醇.当粘度增加后,食物含有过量的水,从而减缓了其运动速度.

植物蛋白质提取的三种protocols 1. TCA/丙酮法： （1）取4g果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。 （2）加入12.5%冰冷的TCA/丙酮（含0.07%β-巯基乙醇），匀浆液在-20 ºC下放置3h，纱布过滤。 （3）滤液在20000g离心30min，收集沉淀。 （4）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。 2. 匀浆法： （1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。 （2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。 （3）匀浆液20000g离心30min。 （4）将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为10%TCA溶液，4ºC下放置2 h。 （5）20000g离心40min，收集沉淀。 （6）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。

3. 酚提取法： （1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。 （2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。 （3）匀浆液20000g离心30min。 （4）在上清液中加入等体积的pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀，10000g，4ºC下离心30min，上层为水相，中间白色物质为杂质，下层为酚相。（注：当提高匀浆缓冲液中sucrose的浓度到1M时，酚相会出现在上层。） （5）回收酚相，加入5倍体积含0.1M 乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀，-20ºC下过夜，沉淀蛋白。 （6）沉淀用含0.1M 乙酸铵的预冷甲醇洗2次。预冷丙酮洗2次。 （7）沉淀在4ºC下干燥，备用。

植物组织蛋白质提取方法 方法一：

1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。

3、用离心机离心8000rpm 40min4℃或11100rpm 20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1M tris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

方法二：三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g尿素0.2g CHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mg PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存