间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠周围神经病的治疗研究

doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2020.06.004

间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠周围神经病的治疗研究淤

杨敏慧摇刘爱群于摇向光红盂摇李金海榆摇(中南大学湘雅医学院附属海口医院神经内科,海口570208)

摇摇中图分类号摇R563摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2020)06鄄0658鄄04

[摘摇要]摇目的:探讨了骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对丙烯酰胺中毒大鼠周围神经病的治疗效果和可能的作用机制。方法:60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和BMSC组,模型组采用丙烯酰胺灌胃大鼠构建中毒性周围神经病模型,建模成功后,BMSC组大鼠经尾静脉注射BMSC1伊107个,对照组和模型组注射等体积的生理盐水。分别在治疗后第0、1、2、3、4和5周分析3组大鼠步态变化;第5周坐骨神经传导潜伏期和神经传导速度的变化;染色分析坐骨神经病理程度,Westernblot分析每组大鼠周围神经组织神经生长因子(NGF)和胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)水平;分析每组大鼠氧化应激水平。结果:与模型组比,BMSC组大鼠治疗后各时间点步态评分明显降低(P<0郾05),神经传导潜伏期明显降低(P<0郾05),神经传导速度显著增加(P<0郾05)。与模型组比,BMSC组大鼠坐骨神经病变病理评分显著下降(P<0郾05),坐骨神经组织NGF和GDNF等蛋白水平显著增加(P<0郾05),外周血中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH鄄Px)和过氧化氢酶(CAT)水平显著增加(P<0郾05)。结论:BMSC可显著提高丙烯酰胺中毒大鼠的神经组织营养因子和抗氧化应激水平,进而改善了中毒大鼠的周围神经病变程度。

[关键词]摇间充质干细胞;丙烯酰胺;周围神经病;氧化应激;神经营养因子

Therapeuticeffectsofmesenchymalstemcelltransplantationonperipheralneuropathyinratswithacrylamidepoisoning

YANGMin鄄Hui,LIUAi鄄Qun,XIANGGuang鄄Hong,LIJin鄄Hai郾DepartmentofNeurology,CentralSouthUniversityXiangyaSchoolofMedicineAffiliatedHaikouHospital,Haikou570208,China

[Abstract]摇Objective:Toinvestigatethetherapeuticeffectandpossiblemechanismofbonemesenchymalstemcells(BMSC)transplantationonperipheralneuropathyinratswithacrylamidepoisoning郾Methods:60SDratswererandomlydividedinto3groups:thecontrolgroup,themodelgroupandtheBMSCgroup郾Themodelgroupwasestablishedbyintragastricadministrationofacrylamidetotoxicperipheralneuropathy郾Thegaitchanges,sciaticnerveconductionlatencyandnerveconductionvelocitywereanalyzedat0,1,2,3,4and5weeksaftertreatment郾Thepathologicalchangesofsciaticnervewereanalyzedbystaining郾Thelevelsofnervegrowthfactor(NGF)andglialcellline鄄derivedneurotrophicfcator(GDNF)inperipheralnervetissuewereanalyzedbyWesternblot郾Thelevelsofoxidativestresswereanalyzed郾Results:Comparedwiththemodelgroup,thegaitscoreandnerveconductionlatencyoftheBMSCgrouphadsignificantlydecreasedateachtimepointaftertreatment(P<0郾05),thenerveconductionvelocitysignificantlyincreased(P<0郾05),thepathologicalscoreofsciaticneuropathysignificantlydecreased(P<0郾05),thelevelsofNGFandGDNFinthesciaticnervetissue,thelevelsofSOD(superoxidedismutase),glutathioneperoxidase(GSH鄄Px)andCAT(catalase)inperipheralbloodofBMSCgroupsignificantlyincreased(P<0郾05)郾Conclusion:BMSCcansignificantlyincreasethelevelsofneurotrophicfcatorsandantioxidantstressinratswithacrylamidepoisoning,therebyrelievingtheperipheralneuropathyinratswithacrylamidepoisoning郾

[Keywords]摇Mesenchymalstemcell;Acrylamide;Peripheralneuropathy;Oxidativestress;Neurotrophicfactors

摇摇周围神经主要是指嗅觉、视觉神经以外的脑神经和脊神经、自主神经及其神经节[1]。而周围神经围神经系统结构或功能损害的疾病,主要表现为运

淤本文为湖南省中医药科研计划项目(201143)和广东省医学科学技术研究基金项目(A2016364)。

于广东药科大学附属第一医院神经内科,广州510008。盂湖南省第二人民医院神经内科,长沙410007。榆海口市人民医院西院内科,海口570208。

研究。

动、感觉和自主神经症状的减弱或者消失[2,3]。丙烯酰胺是一类神经毒性的有机试剂,常用于工业生产和实验研究过程中。持续性接触丙烯酰胺会导致慢性中毒,临床主要表现为周围神经病变[4,5]。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,研究证实间充质干细胞可以发育为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经元细胞、神经胶质细胞以及内皮细胞等,间充质干细胞具有免疫原性低的特点,容易分离培养和遗传背景稳定等优点[6,7]。本研究分析了间充质干细胞对丙烯酰胺中毒性大鼠周围神经的

病变(peripheralneuropathy,PN)主要是指原发于周

作者简介:杨敏慧,女,硕士,副主任医师,主要从事神经修复学

杨敏慧等摇间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠周围神经病的治疗研究摇第6期·659·

影响以及作用机理,旨在为丙烯酰胺类试剂引起的周围神经疾病的治疗提供一定的理论依据。

个/只,对照组和模型组注射等体积的生理盐水。所1郾2郾3摇步态分析和评定摇治疗后第0、1、2、3、4和5周分别采用步态评分[8]分析3组大鼠的步态。将每只大鼠置于树脂盒中观察5min并进行评分,1分:大2分:大鼠站立姿势轻微异常,行走时轻微摇摆、打转,双后肢轻度无力;3分:大鼠能够维持站立,行走时腹部着地,后肢外撇且呈鸭步,双后肢肌力减弱;4分:大鼠无力支撑身体,腹部着地,无法行走。鼠能够站立且行走时步态正常,前后肢活动正常;有大鼠饲养在SPF级动物房,并正常饮食。

1摇材料与方法

1郾1摇材料摇65只雌性SD大鼠,SPF级,4月龄,体质量(200郾0依10郾5)g,购自北京维通利华实验动物有限责任公司,所有大鼠自由摄食饮水,相对温度(26依试验;丙烯酰胺(美国Sigma公司,批号:18099);琢鄄5)益,相对湿度(50依10)%,适应性饲养1周后进行MEM培养基、胎牛血清和胰酶均购自Thermofisher公司FITC鄄CD45、(批号分别CD73、PE鄄HLA鄄DRFITC鄄CD90、为17561、237B1和1834E);鼠抗人IgG1号分别为同型对照单克隆抗体均购自美国单克隆PE鄄CD105、抗体、FITC鄄IgG1PE鄄CD34、PE鄄A1231、A172、1717、1721、1745、1862、1854R&D公司和(PE鄄

批1834E)。和

多克隆抗体和VEGFGDNF小鼠单克隆抗体单克隆抗体购自美国、NGF单克隆抗体和SantaCruz公司(批号分别为C321、3E2W和3907);HRP标记羊180203);HE抗鼠二抗购自杭州华安生物有限公司(批号:限公司dismutase,SOD)、(批号染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有:1789);超氧化物歧甘肽过氧化物酶过氧化氢酶(glutathione(catalase,CAT)化酶(superoxideperoxidase,GSH鄄Px)和谷胱检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号分别为170801、180021和180322);二氧化碳孵箱购自美1郾国2摇Thermo方法公司。

1郾2郾1摇BMSC细胞的制备摇5只SD大鼠断颈处死后,取胫骨和股骨,在无菌条件下将肌肉组织和结缔组织分离,暴露胫骨和股骨。然后将胫骨和股骨中的骨髓细胞采用PBS缓冲液吹出,用红细胞裂解液除去红细胞后将1500r/min离心弃上清,沉淀采用低糖的DMEM培养基(10%FBS+1%青链霉素)重悬后,接种于10cm系细胞培养皿中,在接种后d210更换培养基,洗去未贴壁的细胞,并转移至新的

隔cm3d细胞培养皿中更换新鲜培养基,继续培养,待细胞融合后进行传代,观察细胞形态,,每传至第4代时,采用流式细胞术分析间充质干细胞表1郾面标记的表达情况2郾2摇模型构建分组和治疗。

摇60只SD大鼠随机分为对照组、模型组和BMSC组,每组大鼠20只。20模型组和mg/kg的丙烯酰胺BMSC组大鼠前两周经灌胃给予每只大鼠胃给药一次。以大鼠出现后肢瘫痪视为造模成功,停止给药1周后,再重复灌。

建模成功后,治疗组大鼠经尾静脉注射BMSC1伊1071郾2郾4摇电生理分析摇治疗后第5周,全麻大鼠,背位固定,于坐骨神经旁1~2mm处插入针状刺激电极刺激坐骨神经,于比目鱼肌腹部刺入另一针状电极记录神经肌肉动作电位。采用2郾5倍阈电压连续方波刺激坐骨神经近端。用生理记录仪对神经肌肉动作电位进行处理,测定动作电位潜伏期,并计算神1郾经传导速度2郾5摇神经病理检测,扫描速度为摇治疗后第4000m/5s。

周,每组大鼠在接受电生理检测后处死,取患侧胫神经,用4%多聚0郾甲醛3cm固的神经进行石蜡包埋定后,锇酸染色,然后,切片取胫。神然后采用显微经踝上端约1郾镜观察神经纤维变性程度2郾6摇Westernblot分析摇。

治疗后第5周,取大鼠外周组织50mg,加入组织裂解液100滋l,碾磨匀15浆,在冰上静置裂解1h,然后15000r/min离心白浓度min,。取上清加入上样缓冲液,应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋,金属浴中煮沸30min后,进行SDS鄄PAGE(电压:120V,电流:300mA,时5%间:90脱脂奶粉封闭min),结束后将蛋白质转移至1h后,采用VEGFPVDF(1颐1膜上000)、,用4益NGF(1颐1000)和GDNF(1颐1000)单克隆抗体在用孵育12h,次日用PBST洗涤3次,每次5PBSHRP标记的羊抗小鼠的二抗在室温孵育min,2h,采用发光液洗涤,在化学发光仪上显色蛋白条带3次,每次5min,在PVDF膜上滴加,X胶片进行ECL曝光显影。用ImageJ图像分析各组胶片扫描所得灰度值与内参(Tubulin)的比值,即得VEGF、NGF1郾和2郾GDNF7摇氧化应激指标分析蛋白相对表达量。

摇治疗后第5周,取大鼠外周血,离心得血清,分别采用羟胺法、可见分光光度法和比色法检测所有大鼠治疗后GSH鄄px书进行。

的水平,所有操作严格按照试剂盒操作说明SOD、CAT和1郾3摇统计学分析摇所有数据均采用SPSS17郾0软件进行分析,计量数据采用x依s表示,组间比较采用方·660·中国免疫学杂志2020年第36卷

差检验,两两比较采用LSD法,P<0郾05表示差异有统计学意义。

显著增加(P<0郾05)。与模型组比,BMSC组大鼠神经纤维变性程度(2郾35依0郾68)显著降低(P<0郾05),2郾5摇3组大鼠治疗后神经因子水平比较摇与对照组比,模型组大鼠神经组织中NGF和GDNF显著降低(P<0郾05)。与模型组比,BMSC组大鼠坐骨神经2郾6摇3组大鼠治疗后氧化应激水平分析摇与对照组比,模型组大鼠外周血SOD、CAT和GSH鄄px水平显著降低(P<0郾05)。与模型组比,BMSC组大鼠外2摇结果

2郾1摇BMSC的制备摇在显微镜下观察显示,细胞在d4开始出现贴壁,d7出现集落分布,d10集落刺激采用流式细胞术分析细胞表面标记物显示,细胞表达CD90和CD105,而不表达造血系标志CD45和白细胞抗原HLA鄄DR(图1B)。

可达到80%,细胞形态呈成纤维细胞样(图1A)。

见图3。

组织NGF和GDNF显著增加(P<0郾05)。

2郾2摇3组大鼠治疗后步态分析摇与对照组大鼠比,模型组大鼠建模后1、2、3、4和5周步态显著异常,评分显著增加(P<0郾05)。经BMSC治疗,BMSC组大鼠步态显著改善,治疗评分显著下降(P<0郾05),2郾见图3摇2。

3组大鼠治疗后电生理分析摇与对照组比,模型组大鼠神经鄄肌肉潜伏期明显延长(P<0郾05)。与模型组比(,BMSC明显减缓P<0郾05)。(P<0郾与对照组比组大鼠神经鄄肌肉潜伏期明显缩短05)。与模型组比,模型组大鼠神经传输速度,BMSC组大鼠神2郾经4摇鄄肌肉潜伏期明显增加3组大鼠治疗后神经纤维变性比较(P<0郾05),见表1。摇与对照组比,模型组大鼠神经纤维变性程度(4郾28依1郾18)图1摇BMSC细胞形态和表面标记物分析Fig.1摇

AnalysisofBMSCcellmorphologyandsurf鄄acemarkers

图2摇3组大鼠治疗后步态分析

Fig.2摇Gaitanalysisofratsin3groupsaftertreatment

Note:Comparedwiththecontrolgroup,*郾P<0郾05郾

周0郾05),血SOD、见表CAT2。

和GSH鄄px水平显著升高(P<表1摇3组大鼠神经鄄肌肉潜伏期和传输速度比较(n=20)

Tab.1摇

Comparisonofneuromuscularlatencyandtransmissionvelocityin3groups(n=20)

ControlGroups

groupLatency(ms)TransmissionBMSCModelgroup

0郾1郾92依0郾89依0郾15Fgroup

1郾341)2)

25郾71依4郾speed(滋V)

29依1郾39321)2)

77郾21依0郾8742313郾5郾174郾49依3郾51891P

0郾0000郾000Note:ComparedBMSCgroup,2)withtheP<0郾control05郾group,1)P<0郾05;comparedwiththe

图3摇3组大鼠神经组织神经组织中NGF和GDNF表达

Fig.3摇ExpressionofNGFandGDNFinnervetissueof

3groups

Note:*郾P<0郾05郾

表2摇3组大鼠治疗后氧化应激水平分析(n=20)

Tab.2摇Analysisofoxidativestresslevelsin3groupsafter

treatment(n=20)

ControlGroups

groupSOD(UCAT(nmolGSH鄄px[nmol/(min·g)]1)2)

9郾BMSCModelgroup54郾/ml)12郾81依1郾01依0郾632郾44依1郾01依0郾78/L)651)2)

摇

145郾33依15郾39Fgroup

35郾712依1郾285郾0132834

5郾79依1郾173郾09291102郾34郾91依8郾171)2)

274郾76依19郾92132P0郾000

0郾000

0郾000Note:Comparedgroup,2)Pwith<0郾05郾

thecontrolgroup,1)P<0郾05;comparedwiththeBMSC

杨敏慧等摇间充质干细胞移植对丙烯酰胺中毒大鼠周围神经病的治疗研究摇第6期·661·

3摇讨论

随着工业化程度的不断推进,因接触一些有毒的化合物如丙烯酰胺、烷类和烯类等导致的外周神经损伤病例越来越多。丙烯酰胺等有毒化合物可损伤外周神经,神经一旦损伤则很难恢复,表现为运动、感觉与自主神经功能减弱或消失,严重者可造成肢体感觉丧失或截肢,影响患者的生活和工作。

骨髓间充质干细胞是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的成体干细胞。目前研究证实,将间充是否与BMSC剂量相关仍需要进一步探讨。

综上所述,BMSC可显著提高丙烯酰胺诱导周围神经病大鼠模型的神经组织营养因子和抗氧化应激水平,进而改善周围神经病变。

参考文献:

[1]摇GoolsbyTA,JakemanB,GaynesRP郾Clinicalrelevanceof

metronidazoleandperipheralneuropathy:asystematicreviewoftheliterature[J].IntJAntimicrobAgents,2018,51(3):319鄄325郾[2]摇StaffNP,GrisoldA,GrisoldW,etal.Chemotherapy鄄induced

peripheralneuropathy:Acurrentreview[J].AnnNeurol,2017,81质干细胞移植到脊髓受损的大鼠,可见大量的细胞迁移至神经病变部位,并表达神经元、神经胶质细胞的标记物蛋白,还可促进轴突生长,从而缓解和改善脊髓损伤大鼠的神经功能[9,10]纹状体损伤的模型大鼠,间充质干细胞可迁移至纹状。将间充质干细胞注射体部位并表达和分泌神经生长因子,神经营养因子是一组结构和功能相关的肽类生长因子,广泛调节神经系统神经元的生存和分化GDNF,其家族成员如NGF元的存活及生理功能被证实可促进神经再生和侧索生芽,因此间充质干细胞增强,增强神经和NGF和GDNF表达有助于改善受损的记忆功能[11]实验充分证实间充质干细胞在治疗神经相关疾病中。上述具有潜在的价值。本研究采用间充质干细胞治疗丙烯酰胺中毒所致的外周神经疾病,旨在为有机试剂造成的外周神经疾病治疗提供解决方案。

本研究结果显示,采用丙烯酰胺制备周围神经疾病大鼠,大鼠的步态、外周神经系统以及神经纤维病变显著,提示周围神经病大鼠制备成功。给予周围神经病大鼠BMSC治疗后,可显著改善大鼠的步态,缩短神经肌肉潜伏期和提高患病大鼠神经传导速度,提示BMSC对丙烯酰胺所致的周围神经病具有很好的治疗效果。进一步的研究显示,周围神经病大鼠模型组周围神经组织的神经生长因子NGF和GSH鄄pxGDNF的水平显著降低,机体的生长因子活性或功能降低水平显著降低,提示周围神经病大鼠的神经SOD、CAT和,氧化应激反应明显,组织和机体超氧负离子累积,造成神经元的凋亡和死亡。经BMSC治疗后,神经生长因子NGF和GDNF及机体的BMSCSOD、CAT和GSH鄄px水平均显著增高泌神经生长因子改善或缓解周围神经病症状可能与,进而恢复外周神经功能,提高氧化BMSC,提示分酶活性,显著减缓神经元的死亡,进而达到保护神经组织的目的,与相关文献报道结果类似[12,13]有学者认为BMSC受到细胞存活及趋化性等方面制。但也约,治疗周围神经病的效果并不显著[14],但该结果

[3]摇(6):772鄄781郾

Kimneuropathy:PY,JohnsonareviewCE郾ofChemotherapy鄄inducedrecentfindings[J].Currperipheral

Opin[4]摇Anaesthesiol,2017,30(5):570鄄576郾

Weirylamide鄄inducedX,YanF,EM,neuropathyetal.Neuroprotectiveinrats[J].NeurochemeffectofcalpeptinRes,2015,40onac鄄

[5]摇(11):2325鄄2332郾

SealetranscriptionalSM,FengeffectsQ,AgarwalofacrylamideAK,inetjuvenileal.Neurobehavioralrats[J].Pharmacoland

[6]摇BiochemMukhamedshinaBehav,2012,101(1):77鄄84郾

enchymalYO,GrachevaOA,MukhutdinovaDM,etal.Mes鄄

ofspinalstemcordcellsinjuryand[Jthe].neuronalNeuralRegenmicroenvironmentRes,2019,in14the(2area):[7]摇227鄄237郾

LuomesenchymalR,LuY,stemLiucellsJ,etintheal.treatmentEnhancementofischemicoftheefficacyof

[8]摇BiomedOkoreehPharmacother,2019,109(1):2022鄄2034郾

diseases[J].growthAK,BakeS,SohrabjiF郾Astrocyte鄄specificinsulin鄄like

[9]摇outcomes[J].factor鄄1ChuGlia,2017,65(7):1043鄄1058郾

genetransferinagingfemaleratsimprovesstrokeferentiationZM,LiHB,SunSX,etal.Melatoninpromotesosteoblastdif鄄

[10]摇[J].何Eurofbonemarrowmesenchymalstemcellsinagedrats大鼠缺血性脑梗死免疫炎性反应的影响研究摇霞,Rev崔摇Med璨,陈Pharmacol摇敏郾骨髓间充质干细胞移植对实验性

Sci,2017,21(19):4446鄄4456郾

[J].中国免疫学杂志He,2018,34(5):647鄄652郾

cellsX,CuiexperimentaltransplantationC,ChenM郾ischemiconEffectofbonemarrowmesenchymalstemcerebralimmuneinfarctionin鄄flammatoryinrats[responseJ].ChininJ[11]摇Immunol,2018,34(5):647鄄652郾

王英杰的量效,1561,1565郾

关王系摇晶[J].,石摇中鑫国郾免探讨疫学BMSCs杂志,在治疗大鼠脑损伤时

2018,34(10):1558鄄WangrelationshipYJ,WangofBMSCsJ,ShiintreatmentX郾Toinvestigateofbraininjurytheindoseratseffect[[12]摇ChinGustemY,LiJImmunol,2018,34(10):1558鄄1561,1565郾

J].Z,HuangJ,etal.Applicationengineeringcell鄄derived[J].extracellularJTissueEngmatrixRegeninofperipheralmarrowmesenchymal

Med,2017,nerve11(tissue8):[13]摇2250鄄2260郾

HaoprotectJ,LiS,ShiX,etal.Bonedependentagainstinhibitionn鄄hexane鄄inducedmarrowofautophagyneuropathymesenchymal[J].throughSciRep,beclinstem2018,1鄄in鄄cells

8[14]摇(1):4516郾

Zoutang鄄luo鄄ningDW,GaoYB,ZhuZY,etal.Traditionalchinesemedicine

induced2013,10(2):989670郾

diabeticamelioratesrats[J].sciaticEvidBasednerveComplementinjuriesinAlternatstreptozotocinMed,[收稿2019鄄03鄄25摇修回(编辑2020鄄05鄄17]

摇刘格格)